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Sephadex LH-20

 

全称为:羟丙基葡聚糖凝胶。常用商品凝胶的一种(另一种为交联葡聚糖凝胶。Sephadex LH-20为Sephadex G-25(葡聚糖凝胶按交联度分类的其中一种商品型号)经羟丙基化处理后得到的产物,此时,葡聚糖凝胶分子中的葡萄糖部分将与羟丙基结合成下列醚键形式: -OH → -OCH2CH2CH2OHSephadex G)
与Sephadex G比较,Sephadex LH-20分子中 -OH 基总数虽无改变,但碳原子数所占比例却相对增加了,所以Sephadex LH-20不仅可在水中应用,也可在极性有机溶剂或他们与水组成的混合溶剂中膨润使用。
Sephadex LH20是一种价钱较高的填料,特点: 1、适合用有机溶剂分离嗜脂性分子,可以非常经济地大规模制备各种天然产物 2、结合凝胶过滤、分配色谱及吸附性层析于一身,分离结构非常相近的分子 3、载量可高达300mg样品/ml凝胶,极少需要再生,分离效果可保持十几年不变。
Sephadex LH20 的原理
Sephadex LH20的分离原理是根据分子大小,主要有两方面:以凝胶过滤作用为主,兼具反相分配的作用(在反相溶剂中)。因为凝胶过滤作用,所以大分子的化合物保留弱,先被洗脱下来,小分子的化合物保留强,最后出柱(具体原理可参见分子筛层析)。如果使用反相溶剂洗脱, Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用,所以极性大的化合物保留弱,先被洗脱下来,极性小的化合物保留强,后出柱。如果使用正相溶剂洗脱,这主要靠凝胶过滤作用来分离。
Sephadex LH20 洗脱溶剂
Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类:反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱,以甲醇/水系统最为常见,先用水,逐渐增加甲醇比例,最后用100%甲醇冲柱。正相系统以氯仿/甲醇最为常见,先用50%氯仿/甲醇,逐渐增加甲醇比例,最后用100%甲醇冲柱。
样品的处理和洗脱溶剂的选择
如果样品极性大,就选用反相溶剂洗脱(甲醇/水),样品用最少体积的甲醇/水(尽可能甲醇少一些)溶解,过滤后,湿法上样(一定要滤喔!要是把Sephadex LH20 堵啦,就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去,很心痛呀)。如果样品极性小,这选用正相溶剂洗脱(氯仿/甲醇),样品用最少体积的氯仿/甲醇溶解,过滤后,湿法上样。
分离的技巧
(1) 分离时流速不可太快,切切不可心急,所谓欲速则不达;接馏分时可开全速,节省时间。
(2)柱子尽可能长, Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离,所不要吝惜填料,宁可将填料全装在一根大柱子中,不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力,打击敌人。
(3) 馏分一定要接的细,可1/10,或1/20 个保留体积接成一馏分。
(4) 洗脱体积一般为2-3个保留体积,对特殊保留强的化合物,可洗脱5个保留体积。
(5)鞣质成分死吸附严重,如不在乎填料者,可用Sephadex LH20 分鞣质
(6)Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳,方法很成型,有大量文献参考。
(7)填料反复使用,每次用完,一般可用甲醇将柱子洗干净,然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来,待用。暂时不用试可以水洗→含水醇洗(醇的浓度逐步递增)→醇洗,最后泡在醇中贮于磨口瓶中备用。如长期不用时,可在以上处理基础上,减压抽干,再用少量乙醚洗净抽干,室温充分挥散至无醚味后,60~80°C干燥后保存。
 

Sephadex LH-20性质和操作

干胶溶胀表

排阻极限

4-5KD(球蛋白

溶剂

溶胀体积(ml凝胶/g干胶粉末)

上样量

取决于所需分辩率 

Dimethyl sulphoxide 二甲亚砜

4.4-4.6

尺寸排阻模式

小于总体积的20%

Pyridine 嘧啶

4.2-4.4

正相分配模式

小于总体积的1%

Water 

4.0-4.4

胶粒形状

球形,多孔 

Dimethylformamide二甲基甲酰胺

3.8-4.2

颗粒大小()

18-111μm(直径)

Saline 生理盐水

3.9-4.1

颗粒大小中间值()

70μm(直径)

Methanol 甲醇

3.8-4.1

颗粒大小(甲醇)

27-163μm(直径)

Methane dichloride 二氯乙烷

3.8-4.1

颗粒大小中间值(甲醇)

103μm(直径)

Chloroform 氯仿

3.8-4.1

最大线性流速

720cm/h

Proanol 丙醇

3.7-4.0

参考线性流速

60cm/h

Ethanol 乙醇

3.6-3.9

pH的稳定性

 

Isobutanol异丁醇

3.6-3.9

操作过程

2-11

Formamide 甲酰胺

3.6-3.9

清洗过程

2-13

Methylene dichloride 二氯甲烷

3.6-3.9

化学稳定性

在许多水溶液中都稳定

Butanol 丁醇

3.5-3.8

 

有机溶剂系统中都稳定.

Isopropanol异丙醇

3.3-3.6

 

高压灭菌

Tetrahydrofuran四氢呋喃

3.3-3.6

高压灭菌

121 , 20min

Dioxane 二氧杂环己烷

3.2-3.5

操作温度

4-40

Acetone丙酮

2.4-2.6

保存条件

 

Acetonitrile乙腈

2.2-2.4

新填料

4-25 

Carbon tetrachloride 四氯化碳

1.8-2.2

使用后填料

4-8, pH6-8, 勿冷冻,

Benzene 

1.6-2.0

 

加入抑菌剂(20%乙醇,0.04%叠氮钠)

Ethyl acetate乙酸乙酯

1.6-1.8

 

 

Toluene甲苯

1.5-1.6

 

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